明泰昌年（1620年）間，朝廷征石柱兵東援遼東，秦良玉派兄弟邦屏民屏率五千兵先往，自己攜子領精兵三千繼之。第二年初，秦邦屏率師渡渾河時遭遇一場激烈戰鬥。秦邦屏戰死，秦民屏受傷突圍而出。秦良玉與兒子祥麟兼程赴援，到榆關時，馬祥麟目中流矢，猶拔矢策馬，奮勇而戰不肯退。此役結束後，皇上詔加秦良玉二品章服，並予夫人誥命，賜額曰「忠義可嘉。」其子馬祥麟被授指揮使，贈邦屏都督僉事錫世蔭，與陳策等合祠，民屏進司僉事。
接著，秦良玉奉命回川練兵赴援。到石柱的第二天，忽有一說客樊定邦帶著金銀登門求見。秦良玉召見問道：「爾來有何貴幹？」
「秦夫人，久聞你大名如雷貫耳！我是重慶義軍樊龍之弟樊定邦，今受我大哥之託，特來拜見夫人。」
「你大哥有何見教？」
「我哥期望與石柱土司結盟，共同反抗官府。」
秦良玉眉毛動了一下，沒有吱聲。
樊定邦接著道：「現在川內局面大亂，各地軍民蜂起，奢崇明、奢寅已陷內江、新都諸縣，正進圍成都。樊龍、張彤已據重慶。已殺巡撫徐可求等文武官員五十多人。官府在川的勢力已經奔潰。夫人若肯與我部結盟起義，將來奪得天下，當可共享榮貴。」
「住口！」秦良玉猛然怒罵道，「賊奴敢以逆言污耳，我兵將發，即以奴首祭大纛。」說罷，只一揮手，眾刀釜手立刻將樊定邦牽出司門，在操場上飄揚著「秦」字的帥旗下，立馬斬了樊定邦。秦良玉又吩咐將其送來的禮金犒賞三軍，眾兵勇聞聽歡聲雷動。
秦良玉隨即宣布起兵討賊，首先派秦邦屏之子秦翼明、都司胡明臣領兵四千，銜枚疾趨，潛渡渝江，駐南坪關，扼敵歸路。派秦邦屏子秦拱明，領兵四百襲兩河，焚敵船，阻其東下。裨將秦永成領千兵，分張旗幟山谷間，守護忠、萬、豐、涪，馳檄夔州，急防瞿塘上下。再命其子馬祥麟和親弟秦民屏，率兵六千，沿江而上，水陸並進，占安定、樂至等縣。秦良玉自己統兵數千，由川北路鼓行而西，復新都縣，長驅抵成都，內外夾攻，破奢崇明呂公車。解了成都之圍，再還軍救重慶。秦民屏率部生擒敵將樊虎，殺黑蓬頭，奪二朗關，又奪佛圖關。南坪關等處亦為秦翼明軍所扼。秦拱明殺敵將沈霖於兩河，燒其船千餘只，奪船八百隻。秦良玉兵抵重慶城下，敵將張彤迎戰，馬祥麟驅馬揮刀，只兩個回合，便將張彤斬於馬下。當夜，馬祥麟揮兵攻破通遠門，樊龍遁走，被諸將殺死，重慶城宣告收復。其時，秦永成同胡平志又擊敵將冉應龍於忠州，整個川東乃告平定。捷報傳至朝廷，皇上乃晉封秦良玉為一品夫人，授都督僉事、充總兵官，擢升馬祥麟為宣慰使，秦民屏進副總兵，翼民、拱民進參將。其餘將領均各賞賚有差。
平定川東後，秦良玉繼續領兵進剿。她派裨將秦衍祚從侯良柱敗敵於九節灘，收復了遵義城。派馬祥麟隨巡撫朱燮元攻破江潦四十八寨，攻克永寧、藺州二城，生擒敵官四十三名。又親率翼明、拱明、先後攻破紅崖坡、觀音寺、青山敦諸寨，擒敵將李楫、殺阿么、二郎牌等。此時奢崇明等連結水西安邦彥同反，引苗眾圍貴陽。秦良玉又派秦民屏及其子佐明、祚明，隨黔巡撫王三善救貴陽，大破邦彥於平越，直搗大方。在大方之戰中，王三善不幸為降將陳其愚所害，秦民屏亦被殺死。秦佐明、秦祚民重傷脫逃。朝廷詔贈秦民屏都督同知，立祠賜祭。其子佐明、祚明授參將，翼明、拱明皆進官至副總兵。
明崇禎三年（1631年），永平四城失守，畿輔震動，詔天下勤王。其時中原荒旱，變亂四起，各鎮首領自保不暇，逗留不前。秦良玉獨慷慨誓眾，裹糧率師，晝夜兼行抵都，駐兵宣武門外。其是崇禎帝得知她帶兵抵京，乃傳令親自召見。秦良玉來到平台，崇禎帝對她道「秦夫人，朕久聞你忠勇之名，今特賜蟒玉一件給你。」說罷，命人取出一條尺余長的玉石遞了過去。秦良玉接玉在手，忙叩頭致謝道：「謝主龍恩！臣來京城，願為皇上效命殺敵，請盡吩咐。」崇禎帝道：「爾為巾幗一傑，朕已寫詩四章，同賜你保存。」侍臣將崇禎帝所作御詩展開，秦良玉逐章細讀，只見其一曰：學就西川八陣圖，鴛鴦袖裡握兵符，由來巾幗甘心受，何必將軍是丈夫。其二曰：蜀錦征袍自剪成，桃花馬上請長纓，世間多少奇男子，誰肯沙場萬里行。其三曰：露宿風餐誓不辭，飲將鮮血代胭脂，凱歌馬上清平曲，不是昭君出塞時。其四曰：馮將箕帚掃溝奴，一派歡聲動地呼，試看他年麟閣上，丹青先畫美人圖。
「好，這詩我收下了。」秦良玉歡天喜地叩頭謝恩。
崇禎帝又道：「朕再賜你為太子太保、忠貞侯。」
秦良玉又叩頭致謝，表示願為皇朝戰死疆場，然後才告辭回營。
在京駐防了數日，忽聞蜀地百丈關又來報警，皇上乃命秦良玉還鎮專防川東。秦良玉留下兒子馬祥麟同媳張氏駐京畿防守，自己率軍回到四川。崇禎七年，張獻忠攻陷夔州，兵圍太平。秦良玉提兵急救。馬祥麟此時自北回軍，雙方前後夾擊，張獻忠率部敗走。
崇禎十三年（1624年）四月，羅汝才等復陷夔州，秦良玉率部征剿。其先鋒譚穩已襲擊馬家寨，斬敵首七百三十級。都司秦篆設伏留馬椏，斬其魁首東山虎，生擒敵三十三名。裨將秦永祚，在水口襲擊，殲擊敵五百餘人。秦翼明同別將張全追敵至譚家坪，斬首一千一百一十八級。秦良玉又親率馬祥麟部，在仙寺嶺奪獲羅汝才大旗。是役總計斬敵首八千餘級，繳獲甲仗馬騾無數。敵方喪膽，乃不敢再西犯。但羅汝才敗後與張獻忠合股，於是年七月再占川中。其勢銳不可擋。朝廷這時派楊嗣昌來川督師。楊嗣昌將守川精銳兵力撤往湖南，放棄了川中許多關隘。四川巡撫邵捷春只帶弱卒一萬駐守重慶。秦良玉率部增援。兩軍在重慶附近駐紮，互為犄角。此時有綿州牧陸遜之被罷官到諭。邵捷春讓他到石柱軍中巡視。陸遜之看罷石柱兵營後，擊節讚歎道：「不圖今日見細柳營娘子軍，名不虛傳也。」秦良玉擺下酒席，款待陸遜之時說：「邵公不知兵，吾一婦人受國恩，誼應死，獨恨與邵公同死耳。」陸遜之道：「何出此言？」秦良玉道：「邵公移我自遁去，所駐重慶僅三四十里，而遣張全守黃泥窪，殊失地利，賊據歸、巫萬山之巔，俯瞰吾營，鐵騎建瓴下，張令必破，今破及我，我敗尚能救重慶急乎？且督師以蜀為壑，無智愚知之。邵公不以時爭山奪險，令賊不敢即我，而坐以設防，此敗道也。」
陸遜聞此論，不禁肅然起敬道：「夫人深知兵法，邵公不如也。他聞警畏敵，不敢主動出擊，勢必變被動也。可惜吾一罷官州牧，亦難說服他。那楊嗣昌名為督師，又把精銳撤往楚地，致使川中關隘失守。楊督師與邵巡撫相互不合，蜀中形勢危在旦夕也。」
不數月，張獻忠果然佔得地利，連破官軍於觀音崖、三黃嶺，大軍從上馬渡過河。秦良玉偕張全急忙攔阻，無奈寡不敵眾，一場激戰，所部三萬餘人戰敗潰散。秦良玉飛馬來到巡撫邵捷春處告急道：「邵公，今事急矣，賊已逼近重慶，請盡發吾溪峒卒，可得二萬，我自稟其餼之，官猶足辦賊。」邵捷春搖頭道：「大勢已去，只有堅守勿出。」竟謝其計不用。張獻忠部遂攻陷了劍州、內江、瀘州等地。其後不久，邵捷春被朝廷逮問處死罪。楊嗣昌在襄陽失守後亦飲葯自殺。
崇禎16年（1644年），張獻忠部盡陷楚地，復謀攻佔蜀地。秦良玉圖全蜀形勢，上書給巡撫陳士奇，請其派兵守十三隘口，陳士奇未能用其計。秦良玉又上書巡按劉之勃，劉覺其計雖好，但無兵可派遣，致使張獻忠大軍長驅直抵夔門。秦良玉率部馳援，終因寡不敵眾而敗潰。不久蜀地盡陷。秦良玉這時召集其部將，慷慨語眾曰：「吾兄弟皆死王事，吾以一孱婦蒙國恩三十餘年，今不幸至此，豈敢以余年事逆賊哉。」說罷，乃決定分兵守四境要隘，對手下將領曰：「有從賊者，族無赦。」其部將都聽其約束，各把守關隘，形成了石柱的一統割據局面。張獻忠雖佔全川，又鑄金印，遍招土司，卻無一處響應，敢侵犯石柱，川中來石柱避亂者摩踵相接。又過不久，李自成率軍攻陷北京，明崇禎帝在景山自縊，消息傳來，秦良玉乃知明朝氣數已絕，雖悲慟一時，卻已無可奈何。其子馬祥麟接著又患病逝去，秦良玉自此更加抑鬱不已。至戍子年，秦良玉病卧不起，臨死時，她將孫子馬萬年、馬萬春等招至榻前吩咐曰：「我死賊來，若曹不能拒，城東萬壽山上平下險，我近積火藥糧草於其上，汝率兵民往避之猶可活，此地生靈也。至董戒士卒務在法律嚴明，守御慎密，貴在和協眾志。」言畢，溘然而逝。其壽七十有五。孫子馬萬年、馬萬春等將其葬在城東十五里地之回龍山，其墓碑上鐫明忠貞侯太子太保，官爵在都督總兵之上。
秦良玉死後，馬萬年當了石柱土司，在十年時間裡，仍安居獨統一方。後來世局再亂，馬萬年遵其祖母秦夫人的囑咐，率萬餘人避居萬壽山。不久，朱容藩佔據石柱，圍攻萬