抗戰爆發後，友人紛紛勸周作人南下，從日本逃回國的郭沫若發表《國難聲中懷知堂》說：「我自回國以來所時時懷念著的，卻是北平苦雨齋中我們的知堂。……知堂如真的可以飛到南邊來，比如就像我這樣的人，為了掉換他，就死上幾千百個都是不算一回事的。」
但周作人還是留在了淪陷的北平，他在給陶亢德的信中說：「有同事將南行，曾囑其向王教長蔣校長代為同人致一言，請勿視留北諸人為李陵，卻當作蘇武看為宜。」談到郭沫若的之文，他說：「鼎堂先生文得讀，且感且愧，但不敢不勉耳。」
1938年春夏，周作人和寺內壽一的合照在香港的報紙上刊發後，文協便開除了周的會籍。
同年8月，胡適從倫敦寄給周作人一封信，信中附白話詩一首：「臧暉先生昨夜做一個夢，夢見苦雨齋中吃茶的老僧，忽然放下茶盅出門去，飄然一杖天南行。天南萬里豈不太辛苦？只為智者識得重與輕。夢醒我自披衣開窗坐，有誰知我此時一點相思情。」意在勸其南下，周作人亦回詩一首，訴說自己不南下的理由：「我謝謝你很厚的情意，可惜我行腳卻不能做到，並不是出了家特別忙，因為庵里住的好些老小。我還只能關門敲木魚念經，出門托缽募化些米面——老僧始終是老僧，希望將來見得居士的面。」
周作人拒絕南下的託詞為「上有老、下有小、家累重」，俞芳認為，這只不過是他的託詞，魯老太太根本不是他的負擔，而當時八道灣的孩子們都已經長大，最小的是周作人女兒靜子的兩個孩子，「但但是八個青壯年，帶兩個小孩子，問題應該是不大的」。
盧溝橋事變後，北大南遷，指定年邁且患高血壓的馬裕藻，以及董康、周作人三人留守，保管校產。日本人佔領北平後，多次命周作人請馬裕藻出山任教，馬裕藻讓幼子馬泰將周拒之門外。次數多了，馬裕藻便讓馬泰對周說：「我父親說了，他不認識你。」從此，周才不再登門。
周作人並非開始就有附逆之心，張鐵榮在《周作人平議》中說：「北平淪陷後不久，據一位最後逃出虎穴的北大同學透露，一天，周作人從東安市場回家，路經北大二院，下車看看學校的情形，當時任翻譯的日本人小林過來用日語打招呼，此人有一種大和民族的優越感，平日對教職員毫無禮貌，周作人給他一個冷麵孔，毫不理會，昂首直入，小林立即改用中國話向周致意，並連連道歉，周作人還斥責了他對教職員語勢之不當云云。……人們還不知道，周作人曾和馬幼漁一起痛罵過當時已附逆的原北大日文教授徐某，時間是日本侵略軍佔據北平之後大約半年……」
1939年元旦早晨，有人冒充學生到八道灣拜訪周作人，進門便抬手給了周作人一槍，子彈打中周腹部。刺客還打上了當時在周家作客的周作人弟子沈啟無，在逃走時，又打死了周家的一名車夫。
周當天穿的是新棉袍，子彈穿過棉袍打在他穿的毛衣的衣扣上，只是劃傷了他的皮膚，但周堅持說子彈打進肚子里了。事後到醫院做了檢查，並沒有發現子彈，後來周在穿毛衣時發現了變形的衣扣，又在客廳找到了子彈。但周卻極為惶恐，他同意由日本人安排警署派三名便衣警衛進駐其家中。出於安全考慮，他辭去了郊區的燕京大學教席，隨後出任偽北大文學院院長一職。
周作人說刺客是日本人，有人說是「抗日鋤奸團」，也有人說是愛國青年學生，又有人說是周作人的侄兒周豐三因無法阻止伯父當漢奸而決定乾脆殺了他，與幾個志同道合的同學所為。但無論哪種說法，都沒有得到證實，至今是個疑案。
鮑文蔚曾問周作人為何有人要加害於他時，周輕描淡寫地說：「可能有人覺得我可惡吧。」
周作人任偽職後，文化界傾力勸周作人南下，茅盾、郁達夫、老舍、馮乃超、王平陵、胡風、胡秋原、張天翼、丁玲等18人發表公開信，希望周做「文壇蘇武」，「幡然悔悟，急速離平，間道南來」。當時甚至有「城可失，池可破，周作人不能投降」的口號。
周海嬰記載，周作人對日本的態度越來越曖昧時，正上中學的周建人與羽太芳子的次子周豐三多次勸說二伯父懸崖勒馬，周作人並不理會。周豐三鬱鬱寡歡，最後竟以死相諫，但周作人仍不為所動。
1941年，周作人出任偽國民政府委員、為華北政務委員會常務委員兼教育總署督辦等職務，文化界一片嘩然。艾青說：「周作人，在我們最需要他的時候，背叛了我們！」
依附日本人後，周作人大興土木，翻蓋了八道灣的住宅，卧室也完全改建成日式的榻榻米，家中傢具、物品都從日本商店購買，家人生病也請日本醫生診治。家人過生日、過滿月都要慶賀，中日車水馬龍，宴席不斷。張琦翔說，八道灣苦雨齋原本是學子、教授願意來的，推門即入，不拘形跡。當周成了偽督辦，翻蓋房子後，給朋友們發通知說，每周一、三、五下午四至六時會客。而逢著會客日，周家有好多官僚，於是朋友們便不大到苦雨齋了。
周作人剛開始大概還抱有「學校可偽，學生不偽，政府雖偽，教育不可使偽」的想法，於浩成在《關於周作人的二三事》中說：「1941年12月8日太平洋戰爭爆發後，日本當局於上午七八時即按原定計畫派軍隊進駐燕京大學，將代校長陸志韋、張東蓀、趙紫宸、鄧之誠等教授聚在一起，準備解去關押……聽我父親說（董魯安，原燕京大學教授，後為晉察冀邊區參議會副議長），陸志韋先生在匆忙中低聲告一位懂日語、以前經常代表燕大校方與日本當局聯繫、辦理交涉的蕭先生說：『找周豈明！』可見周作人還是起到某種緩衝甚至『保護』作用的。」
某日，偽新民會通知北平各校學生到天安門參加慶賀皇軍佔領宜昌大會，教育總署請示督辦周作人，周認為學生應遠離政治，參加與否，無關宏旨，教育總署便按其意思通知各校。次日，各校照例放假，無一學生到會。偽新民會顧問安騰大怒，要親自去逮捕周作人，經人力勸才作罷。自此，各校有會必到，到必搶先，而周作人則再不敢管此類事情了。
之後，周作人這個督辦便進出於各類教育會議及各類講習班、訓練班，沒會必到，訓詞、訓示也是：「現在所施行的教育方針，是以親仁善鄰為主旨」，「總之，藉著教育行政的力量，以圓滿達到善鄰友好、共同防共、經濟提攜的三種目的」等。
1941年4月，周作人與錢稻蓀等人赴日本出席東亞文化協議會文學部會，據當時報紙報道：「14日，周作人一行抵東京」，「上午十時晉宮問候，詢問陛下康強後，更赴大宮御所秩父官邸問候。正午出席文相官邸中橋田文相主辦之午餐會。下午一時半，赴高松莒御殿問候。二時半，參拜明治神宮，其次更參拜護國英靈之靖國神社，東亞永久和平之志向相同，之一行均誓言真心，徑往宿舍雲」。此行，周作人還慰問了在侵華戰爭中受傷的日本軍人。
范紀曼回憶，四十年代初，周作人到中央大學講演，當時中大在地下黨員范紀曼的領導下發生了反對偽校長樊仲雲的學潮。范在講演前找到周作人說明情況，但並沒有透露自己的共產黨員身份，周聽罷說道：「我的演講，你們樊校長一定會失望地。我從『五四』到『三一八』，也是站在學生方面的。」果然，周的講演《中國的思想問題》贏得學生們的陣陣掌聲，而坐在主席台上的樊仲雲等人則顯得非常狼狽。
周作人任督辦期間，曾多方照顧李大釗的長女李星華，幫助李星華、李光華姐弟辦「良民證」，協助他們從北平轉移至延安，掩護李大釗此女李炎華及其夫侯輔庭。他還曾營救中共地下黨員高炎。
周作人還與國民黨方面接觸，曾多次找國民黨北平地下市委委員沈兼士「閑談」。抗戰勝利後周作人受審時，國民黨地下工作者張懷、董洗凡等人為其作證，稱周曾有掩護或聯名保釋被捕人員的舉動。
周作人一方面附和日本人的大東亞文化理論，另一方面又希望能保持知識分子的獨立，他的這種矛盾，觸怒了日本人。1943年8月，日本人片岡鐵兵斥責周作人為「中國反動老作家」。
任偽職期間，周作人曾對友人說：「我現在好比是站在戲台上嘗門便看戲的看客。」
晚年，周作人在給鮑耀明的信中說到自己任偽職的原因：「關於督辦事，既非脅迫，亦非自動（後來確有費氣力自己運動的人）。當然是由日方發動，經過考慮就答應了，因為自己相信比較可靠，對於教育可以比別個人出來，少一點反動的行為也。……此處又任華北綜合調查研究所副理事長，當時有人也有勸我不要乾的，但由於上述的理由，遂決心接受。」
60年代，周作人對張鐵錚談及他當年任偽職之事時，張說：「這是日本人『脅迫』的。」周說：「我當時同意了，以後擔任過偽職的人，受到查處是當然的。」談及去長春見溥儀之事，周說：「我去長春是汪精衛點的名，不過我見溥儀的興趣遠不如見羅振玉興趣大，我見到了羅振玉。」