魯迅和周作人，生長在同一個家庭里，受相同的教育，都上新學堂，都到日本留學，一起以「周綽」的筆名發表作品，一起翻譯作品，一起到北大教書，五四時期，一起投入新文化運動，但後來兩人所走的道路，卻截然不同。
1923年7月14日，魯迅日記記載：「是夜始改在自室吃飯，自具一餚，此可記也。」17日，周作人的日記曾記載有關於他與魯迅矛盾的內容，但被他剪去了。19日，周作人將一封絕交信交給魯迅，信中寫道：「魯迅先生：我昨天才知道，——但過去的事不必再說了。我不是基督徒，卻幸而尚能擔受得起，也不想責誰，——大家都是可憐的人間。我以前的薔薇的夢原來都是虛幻，現在所見的或者才是真的人生。我想訂正我的思想，重新入新的生活。以後請不要再到後邊院子里來，沒有別的話。願你安心，自重。七月十八日，作人。」這日魯迅日記中記載：「上午啟孟自持信來，後邀欲問之，不至。」8月2日，魯迅與朱安搬出了八道灣，周作人在日記里記載：「下午L夫婦移住磚塔衚衕。」L指魯迅，周作人在日記中已不願再提到魯迅的名字。
雖然失和，但兄弟二人卻沒有斷了聯繫，他們都在《語絲》寫文章，有共同的朋友，周建人、川島不止一次充當了二人溝通的橋樑。二人還一致對外，在女師大驅趕校長楊蔭榆的風潮中，周作人在魯迅起草的《關於女師大風潮的宣言》上籤了字；在魯迅與陳源的比戰中，周作人毫不猶豫站在了長兄一邊。
但這種說法許多學者認為比較牽強。1911年5月，周作人夫婦歸國。1912年5月16日，羽太信子分娩，得一子。其弟羽太重九攜妹羽太芳子來紹興，照顧產婦。魯迅7月10日寄「羽太家信」，並不是寄給羽太信子的信，而是寄給日本羽太家的信。當時羽太信子在浙江紹興，6月12日、6月29日曾兩次給魯迅來函，估計是向魯迅要錢。魯迅「寄羽太家信並日銀十元」，顯然與羽太信子來信有關。魯迅也曾復羽太信子信，日記寫明是「與二弟婦信」，而不是「寄羽太家信」。
魯迅對兄弟極好，特別是對周作人。周作人和羽太信子結婚後，留學官費不夠用，魯迅便回國，到浙江兩級師範學堂任教，供養弟弟，支助弟媳一家（魯迅多次支助信子的弟弟羽太重九，並負擔其三次來中國的費用，還支付信子的三妹福子的學費）。魯迅對好友許壽裳說：「你回國很好，我也只好回國去，因為起孟（即周作人）將結婚，從此費用增多，我不能不去謀事，庶幾有所資助。」
1917年，經魯迅推薦，蔡元培聘周作人為北京大學中文系教授。這年，周作人出疹子，北京時正流行猩紅熱，魯迅很是害怕，愁眉不展，四處告貸，為周作人延醫買葯。得知周作人為出疹子後，便精神煥發地對許壽裳說：「起孟原來這麼大了，竟還沒有出過疹子……」他對周作人說，在你病重的時候，「我怕的不是你會得死，乃是將來須得養你妻子的事」。當時會館設施極為簡單，周作人病中，沒有便器，小便只能用大玻璃瓶，大便則將骨牌凳反過來，中間放上洋簸箕，簸箕里鋪上厚粗草紙。每天周作人方便後，都是由魯迅親自倒到院子里的茅廁去。
1919年底，魯迅全家搬入八道灣（今北京新街口），這出房屋為魯迅選購，並親自設計修建。魯迅選中此處，是看中八道灣空地寬大，適合弟弟的孩子們遊玩。而在魯迅購物裝修之時，周作人卻攜妻赴日本探親遊玩。
1920年底，周作人患肋膜炎，魯迅極為著急，又此處奔走，為弟弟籌集藥費。因八道灣人多嘈雜，魯迅將周送至西山碧雲寺靜養，他在這一天的日記里憂傷地寫道：「清晨攜二弟往西山碧雲寺為二弟整理所租屋，午後回，經海甸（今北京海淀）停飲，大醉。」
周作人不僅與長兄魯迅失和，與三弟周建人的關係亦不睦。
周作人、周建人的孩子淘氣，在窗下玩火，魯迅看見了，訓誡幾句。信子知道後，罵道：「為什麼偏給他看見！」
徐淦回憶，他在與周作人日常閑談中常提到魯迅，「知堂很很坦率，從他的口吻中，我聽出他對傑出的兄長之愛和敬，始終如一，像兩人兒時、少時、青壯年、中年時的莫逆有增無減」。羽太信子一次給徐送茶時，也提到魯迅，周作人當時翻譯信子的話說：「內人告訴足下，自從足下來後，院子里的左鄰右舍，都對她說，她們覺得又像過去大先生住在這裡的時候，看到通宵在燈下干夜活的情形了，她們對大先生都是很敬愛、挺懷念的。」
魯迅一次次示好並沒有得到周作人的響應，一直到他去世，兄弟二人都未能和解。
周建人聽了這話，覺得他還不明白，還以為自己是八道灣的主人，而不明白其實他早已是一名奴隸。
一次，周作人的一部譯稿交給商務印書館出版，魯迅去時，編輯正在校勘，魯迅說：「啟孟的譯稿編輯還用得著校嗎？」在商務印書館工作的周作人說：「那總還是要看一遍的吧！」魯迅這才默不作聲了。
1964年，周作人在寫給香港友人鮑耀明的信中說，趙聰的《五四文壇點滴》中「關於我與魯迅的問題，亦去事實不遠，因為我當初寫字條給他，原是只請他不再進我們的院子里就是了。」趙聰的《五四文壇點滴》中有關周氏兄弟失和的文字，除引證魯迅日記中有關兄弟失和的記載外，也僅有如下幾句：「許壽裳說過，他們兄弟不和，壞在周作人那位日本太太身上，據說她很討厭她這位大伯哥，不願同他一道住。如此推斷，周氏兄弟失和的原因是羽太信子不願同魯迅一道住。」
魯迅知道周作人的「日本情結」，在逝世前特地讓周建人轉告周作人：「遇到此等重大問題時，亦不可過於後退。」
1925年，周作人發表短文《傷逝》，其中引用了一首羅馬詩人的詩，中有：「兄弟，只囑咐你一聲珍重！」之句。不久，魯迅亦發表小說《傷逝》，開篇便說：「如果我能夠，我要寫下我的悔恨和悲哀，為子君，為自己。」晚年，周作人在《知堂回想錄》中這樣寫道：「《傷逝》不是普通戀愛小說，乃是假借了男女的死亡來哀悼兄弟恩情的斷絕的……我也痛惜這種斷絕，可是有什麼辦法呢，人總只有人的力量。」
俞芳在《我記憶中的魯迅先生》一文中提到，魯老太太曾對人說：「這樣要好的弟兄都忽然不和，弄得不能在一幢房子里住下去，這真出於我意料之外。我想來想去，也想不出個道理來。我只記得：你們大先生（魯迅）對二太太（信子）當家，是有意見的，因為她排場太大，用錢沒有計畫，常常弄得家裡入不敷出，要向別人去借，是不好的。」魯老太太還說：「我說句實在話，分開倒對你們大先生有利。」「只當我少生了他（周作人）這個兒子。」
周建人還提到，一次，周作人說要把岳父母接到中國來同住，魯迅很不贊成，認為多年來寄錢供養他們，已經情至義盡了，今後可以繼續養老送終；他們還有別的子女在日本，就不必接到中國來了。
周作人少時，晚上睡下後常聽魯迅講故事。當時魯迅已經十五歲，看了《十洲》、《洞冥》等書，每天晚上睡下後不立即就寢，而是將書中看到的仙怪鬼神的傳說講給周作人聽，講的頗為細緻。後來，魯迅、周作人、周建人還三兄弟商量好，把壓歲錢湊在一起，合買了一本《海仙畫譜》。魯迅講的故事，周作人已不太記得，只是大哥講仙怪的情形卻是他永生難忘的，直到晚年所寫的《兒童雜事詩》里，周作人仍然表示了不勝懷念的心情：
1924年6月，周作人寫《破腳骨》一文，據川島說，此文是針對魯迅，在文中，周暗示魯迅是個「無賴子」。
「我豢養了他們，他們卻這樣對待我。」
關於周氏兄弟失和之事，流傳有各種猜疑，有的說是魯迅偷看羽太信子洗澡被發現；有人說是魯迅趁周作人不在，調戲弟媳，遭到羽太信子的拒絕後，兄弟失和；也有人以弗洛伊德的性心理學說來套魯迅，說他本來對羽太信子就垂涎已久，性壓抑得不到釋放，試圖勾引弟媳被拒後，便惱羞成怒，與周作人夫婦打了一架後離開了八道灣；更有人說羽太信子原為魯迅的戀人，後被周作人奪愛；通說認為，周氏兄弟因為文化上的觀點不同，再加上羽太信子的從中挑撥，造成兄弟失和。但無論哪種說法，有一點是肯定的，就是周氏兄弟的斷交，是因為家庭矛盾，與羽太信子脫不了干係。
日本作家增田涉說：「他（魯迅）常買糖果給周作人的小孩（他自己那時沒有小孩），周作人夫人不讓他們接受而拋棄掉。他用充滿感慨的話說：好像窮人買來的東西也是髒的。這時候使我想起他常說的『寂寞』這個詞來。」
魯迅也曾對許廣平談及八道灣時的生活，他說，羽太信子花錢大手大腳，什麼都要買日本貨，一有錢就到日本商店買上一大堆；周作人一家無論大病小病，都要請本醫生來診治。錢花光了，便由魯迅去借，有時魯迅借了錢急忙回家，到門口看見日本醫生的汽車，魯迅