1903年，劉師培在上海結識陳獨秀，二人先後參與了《國民日報》和《警鐘日報》的創辦。劉師培因考場失意辱罵科舉，遭到通緝而逃到上海。陳獨秀因在安慶藏書樓發表了愛國演說，被端方通緝潛逃滬上。因有「同是天涯淪落人」相同際遇，又有強烈的反滿情緒，二人過從甚密，時時相聚談說志向。
1903年冬，陳獨秀回到蕪湖，創辦《安徽俗話報》。臨行之時，陳獨秀送章士釗和劉師培詩云：「勤王革命皆形跡，有逆吾心罔不鳴。直尺不遺身後恨，枉尋徒屈自由身。馳驅甘入棘荊地，顧盼莫非羊豕群。男子立身惟一劍，不知事敗與功成。」署名「陳由己」。劉師培深有感喟，在詩下題曰：「由己，由己，由一己所欲。」
回到安徽後，陳、劉書信往來頻繁。陳獨秀按時將《俗話報》寄給劉師培。陳獨秀的朋友何梅士病逝後，陳獨秀作《哭何梅士》詩，劉師培將發表在《警鐘日報》上。後劉又向陳約稿，陳獨秀作《夜夢亡友何梅士覺而賦此》。劉師培收藏了陳獨秀此文的底稿，並在稿下戲道：「由己乎？不由己已，不由己已耳，不由己已耳矣！」
劉師培加入蔡元培等人組織「國民教育暗殺團」（即光復會的前身），並與章士釗同向蔡元培舉薦「江淮志士」陳獨秀。章士釗推薦陳的理由是：「此君志大心雄，有一種不峻之坡弗上的鬥志，而且人格甚美，忠於人，忠於事，不乏俠士之風。」劉師培則說：「陳君還是吾報的作者。他重友情，講信用，在蕪湖創辦並發行一種白話報，發起的若干人都因困苦及危險而散去了，他一個人還在干，已經支持了好幾個月。」
陳獨秀與皖江中學體育教員柏文蔚在蕪湖成立暗殺組織。《警鐘日報》被查封后，陳獨秀邀請劉師培到皖江中學任教。不久，劉師培化名「金少甫」赴蕪湖。劉師培來到後，往往以光復會的欽差大臣自居，而陳獨秀不承認蕪湖的組織與上海的組織是下級與上級的關係，劉與陳產生齟齬。
1907年，劉師培、陳獨秀先後東渡日本。在日本時，劉師培與章太炎為「攘奪幹部職權」，曾想拉攏陳獨秀及蘇曼殊。但陳獨秀認為「光漢」是狹隘民族主義，拒不參與其中。
後劉師培投靠端方，端方入川受戮，劉師培被捕入獄。1912年初，得知劉師培的下落後，陳獨秀上書孫中山，義保劉光漢。在給孫的上書中，陳獨秀曆數劉之功德，以「神經過敏」為之開脫。
1917年，陳獨秀應蔡元培之邀擔任北京大學文科學長。此時的劉師培身體虛弱，生計維艱，他告知蔡、陳，欲進北大任教。陳獨秀、蔡元培不計前嫌，聘請劉師培為北大教授。
1918年，新文化運動蓬勃發展，劉師培執著於舊學，他糾集北大的一班守舊師生，創辦《國故》雜誌，對陳獨秀的《新青年》對壘。
1919年6月11日，陳獨秀被捕。次日，病魔纏身的劉師培在夫人何震的陪同下，強撐身體，與北京大學的新舊學者們一起聯名上書，請求保釋陳獨秀。9月16日，陳獨秀出獄。卧床不起的劉師培欲前往迎接，終因力所不逮作罷。
陳獨秀出獄一個多月後，劉師培病情加重，陳多次前往看望。11月10日，年僅三十六歲的劉師培病逝，陳獨秀主持了劉的喪禮，並引用康有為詩悼念亡友：「曲徑危橋都歷遍，出來依舊一吟身。」