清軍佔領西安後，多爾袞命多鐸按原計畫移師進攻南明弘光政權，阿濟格部由陝北南下追擊大順軍。這時李自成正帶著軍隊進至河南內鄉一帶。據說，李自成曾有意直趨南京，搶在清軍之前佔領東南財賦之區，由於顧君恩的竭力勸阻，才決定南下襄陽、承天 。阿濟格受命進攻陝北時，曾經迂道蒙古部落索取馬匹，受到攝政王多爾袞的嚴厲訓斥，責成他「將流寇餘孽務期剿除，以贖從前逗留之咎。」 阿濟格不敢怠慢，在任命了西北地區官員之後隨即率師南下。當時大順軍在數量上仍然超過清軍，但是連續大敗之後，士氣低落，撤退時又拉家帶口，行動遲緩。正月二十九日，主力撤到河南內鄉後，在這裡停留了較長的時間，直到阿濟格部清軍追了上來時，才於三月十八日拔營南下湖北 。
據阿濟格向清廷的報告，這年三月到四月，清軍先後在河南鄧州、湖北承天（鍾祥）、德安（安陸）、武昌、富池口（湖北陽新縣境）、桑家口、江西九江等七地，接戰八次，大順軍都被擊敗 。這裡所說的八次戰役，並不都是大順軍主力同阿濟格部清軍展開的正面交鋒，但卻反映了大順軍從西安撤退下來的行經路線和清軍的追擊情況 。
三月，大順軍由承天進抵漢川、沔陽，南明鎮守武昌的左良玉告急。明江西總督袁繼咸以為大順軍將沿長江北岸向南京進軍，就帶了一部分軍隊趕往蘄春，同武昌的左良玉部相呼應。大順軍卻從沔陽州的沙湖和對岸簰州之間渡過長江，在荊河口擊敗左良玉部將馬進忠、王允成的駐防軍，使「武岳大震」 。左良玉嚇得魂飛魄散，只好借著「北來太子」 問題大做文章，打起清君側的旗幟，聲稱要打到南京，討伐馬士英、阮大鋮。左軍於三月二十三日全師東下後，武昌遂無駐軍，李自成乘機佔領該城。
李自成當時的計畫是奪取東南作為抗清鬥爭的基地，所謂「西北雖不定，東南詎再失之？」 到達襄陽時，他麾下的士卒有從西安帶來的十三萬，又把原先部署在襄陽、承天、德安、荊州四府駐防的七萬人調集隨營，合計二十萬眾，「聲言欲取南京，水陸並進。」 李自成把襄、荊四府的駐防軍調隨主力東下，是因為同清軍爭奪南京，需要這支比較完整的生力軍。但是，這次集中兵力的做法是失策的，當時負責鎮守德安的大將白旺就曾提出意見，認為這些地方經過一年多的經營，已經比較鞏固，駐防軍也不弱，應當固守。但這個正確的建議沒有為李自成所接受，白旺沒有辦法，只好奉命行事。所以當阿濟格部清軍尾追而來時，大順軍後方空虛，根本沒有力量阻滯清軍前進。
李自成剛到達武昌不久，清軍就跟蹤而至，「圍武昌城數匝」 。劉宗敏、田見秀領兵五千出戰，敗還，大順軍只好棄武昌東下 。從現有的材料來看，大順軍當時向東南方面進發，戰線拉得比較長。南明江西等地總督袁繼咸在三月下旬曾向朝廷報告：「闖賊下走蘄黃，上犯荊岳」 。所以他當時派出署總兵鄧林奇等增援蘄黃，自己則準備帶副將汪碩畫等領兵往江西袁州，防備大順軍由岳陽進入湘贛。
大順政權由於沒有留下較多的兵力扼守地方，又沒有適時地組織必要的反擊，只是一味地東進，這種顧前不顧後的做法終於招致了慘重的失敗。四月，清軍追至陽新富池口，趁大順軍不備沖入營壘，使大順軍又一次失利。同月下旬，在距江西九江四十里處被清軍攻入老營，大順軍久歷戰陣、功勛卓著的大將劉宗敏被俘，軍師宋獻策、明降將左光先、李自成的兩位叔父趙侯和襄南侯以及大批隨軍的將領家屬也被清軍俘獲。劉宗敏和李自成的兩位叔父當時就被殺害，宋獻策和左光先卻可恥地投降了 。就在這前後，丞相牛金星認為大勢已去，竟然不告而別，開了小差。牛金星的兒子牛佺原任大順政權的襄陽府尹，在大順軍節節敗退的情況下，也認賊作父，投降了清朝，被委任為黃州知府，後來又升任湖廣糧儲道。牛金星逃離大順農民革命隊伍後，一直住在牛佺的官衙里，享受著老太爺的清福，直至壽終正寢 。「千古艱難惟一死，傷心豈獨息夫人？」以一個封建落魄文人出身、被李自成委為文臣之首的牛金星所走過的生活道路確實是耐人尋味的。
大順軍在湖北陽新、江西九江連遭重大挫折之後，東下的去路已被清軍截斷，所掌握的數萬艘船隻也被清軍掠奪一空，多鐸部清軍已由河南歸德（商丘）、安徽泗州直趨南京，李自成原先的戰略意圖已無法實現。不得不掉頭向西南方向進軍，準備穿過江西西北部轉入湖南。五月初，李自成行至湖北通山縣境九宮山下，突然遭到當地地主武裝 襲擊。當時跟隨在他身邊的只有義子張鼐和二十八名戰士。地主武裝見兵馬不多，就一擁而上。二十八名戰士先後被擊殺，李自成也在搏鬥中壯烈犧牲。關於李自成犧牲的情況，明末清初人士費密所著的《荒書》里有這樣一段記載：
「自成親隨十八騎，由通山縣過九宮山嶺，即江西界。山民聞有賊至，群登山擊石，將十八騎打散。自成獨行至小月山牛脊嶺。會大雨，自成拉馬登嶺。山民程九百者下與自成手搏，遂輾轉泥滓中。自成坐九百臀下，抽刀欲殺之，刀血漬，又經泥水，不可出。九伯呼救甚急，其甥金姓以鏟殺自成，不知其為闖賊也。武昌已系大清總督，自成之親隨十八騎有至武昌出首者，行查到縣，九伯不敢出認。縣官親入山，諭以所殺者流賊李自成，獎其有功。九伯始往見總督，委九伯以德安府經歷。」
關於李自成犧牲的地點和時間，各種史籍記載分歧很大。地點問題有通城說 ，通山說，辰州說 ，新昌說 ，等等。有的書說李自成並沒有犧牲，而是病死於羅公山 ；甚至說他兵敗以後遁往湖南石門縣夾山寺 ，或湘黔交界的清水江畔野寺 ，或山西五台山 當了和尚。史學界在一九五六年考證自成犧牲於湖北通山縣 ，其說良是，茲不贅。時間問題，《明史》載於九月，他書或作四月、五月、六月、八月以至順治三年，主張石門為僧說的人甚至認為「李自成」（即奉天玉和尚）圓寂於康熙十三年，但絕大多數都是依據傳聞和推測。近年來，學者多傾向於五月說，但究竟在五月的哪一日，尚無定論。康熙四年《通山縣誌》載，「順治二年五月初四，闖賊數萬入縣，毀戮四境，人民如鳥獸散，死於鋒鏑者數千，蹂躪三月無寧宇。」 同書又說：「程九伯，六都人。順治二年五月，闖賊萬餘人至縣，蹂躪燒殺為虐，民無寧處。九伯聚眾，圍殺賊首於小源口。本省總督軍門佟嘉其勇略，札委德安府經歷。」 與大順軍相比，程九伯等地主武裝在力量上是微不足道的。當時的各種文獻都說，他們之所以敢於向李自成及其隨從發起攻擊，是因為不知道出現在面前的這支小隊伍就是聲名赫赫的大順軍，更不知道其中就有大順皇帝在內。何騰蛟在前引疏中就說，「闖勢實強，闖伙實眾，何以死於九宮山團練之手？誠有其故。」緣故就在於「鄉兵初不知也。使鄉兵知其為闖，氣反不壯，未必遂能翦滅……。」 所以，如果大順軍大隊人馬賓士而來的話，這種局面是不可能出現的。比較合理的解釋是，李自成帶著近三十名隨從，行進在大隊人馬之前（作為全軍統帥也不可能距離大隊太遠） ，鄉團練見來人不多才敢於上前尋釁。在劉姓伴當逃回報告「李萬歲爺被鄉兵殺死馬下」的惡耗後，大順軍「滿營聚哭」 ，部下將士對通山縣一小撮地主武裝立即實行報復性打擊乃是必然之事。就是說，李自成的倉猝遇難，同大順軍在通山的「毀戮四境」應是同一天發生的事。如果這一推斷能夠成立的話，李自成犧牲的日期，可初步確定為順治二年五月初四日 。其他材料也有助於推斷李自成遇難的日期。康熙《寧州志》載，大順軍攻克寧州是在五月十三日 。江西寧州（今修水縣）同湖北通山接境，大順軍在領袖遇難以後必然要經過一番料理，將近十天之後這部分大順軍才進抵寧州，也在情理之中。
李自成這位中華民族歷史上最傑出的農民革命領袖犧牲了。他把一生獻給了反對階級壓迫和滿洲貴族民族征服的革命事業。在他領導下，受盡欺凌壓榨的貧苦農民挺起了腰，抬起了頭，向腐朽透頂的封建統治進行了勇猛的衝擊，在廣闊的土地上蕩滌了地主階級的污泥濁水，推翻了以朱由檢為頭子的明王朝。直到他犧牲時為止，他所領導的大順軍以大無畏的氣概，獨立地承擔了抗清鬥爭的全部重任，為爾後二十年的抗清鬥爭揭開了序幕。以李自成為代表的明末起義農民們創建的豐功偉績，將永遠光照史冊，受到後世人們的景仰。