伯羅奔尼撒戰爭使希臘諸城邦大傷了元氣，與此同時希臘北部一個貧瘠落後、默默無聞的城邦——馬其頓卻逐漸強大起來。公元前338年，馬其頓軍隊大敗希臘聯軍於喀羅尼亞城下，確立了在全希臘的霸主地位。馬其頓的下一個目標，便是東方的波斯及其他文明世界。公元前336年，馬其頓王腓力二世遇刺身亡，他的兒子亞歷山大登上王位，時年20歲。他決心繼承父業，實現其稱霸世界的宏願。
亞歷山大（前355—前323年）才智卓絕，勇武過人，13歲時就師從希臘著名學者亞里士多德，接受系統的希臘文化教育。他醉心研究兵法，16歲起隨父出征。在著名的喀羅尼亞戰役中，18歲的亞歷山大任副統帥，指揮左翼主力取得輝煌戰果。亞歷山大繼承王位之後，即著手仿效希臘人的制度，實行政治、軍事改革，削弱氏族貴族的勢力，加強君主的權力；改革貨幣，獎勵發展工商業；最重要的是軍事改革，他創立了包括步兵、騎兵和海軍在內的馬其頓常備軍，將步兵組成密集、縱深的作戰隊形，號稱馬其頓方陣，中間是重裝步兵，兩側為輕裝步兵，每個方陣還配有由貴族子弟組成的重裝騎兵，作為方陣的前鋒和護翼。亞歷山大通過這些改革，使馬其頓的軍事實力更加強大。亞歷山大在進行了充分準備之後，首先出兵，撲滅了馬其頓和希臘各地的反叛硝煙，鞏固了專制王權，然後便著手實施其父的遠征波斯計畫，以攫取東方的財富。
公元前334年春，亞歷山大率領馬其頓和希臘各邦的聯軍，包括步兵3萬人、騎兵5000人和160艘戰艦，渡過達達尼爾海峽，向波斯進軍。雖然亞歷山大所率領的軍隊規模對於統治西亞和埃及的龐大波斯帝國而言不算龐大，但是當時的波斯帝國已經衰弱，大流士三世昏庸無能，政治腐敗，內部矛盾重重。亞歷山大以快速的攻勢輕易地征服了小亞細亞半島。公元前333年，亞歷山大的軍隊在伊蘇斯大敗波斯軍隊，波斯國王大流士三世落荒而逃，王室眷屬被俘，損失步兵、騎兵約10萬人，輜重全部丟失。
公元前332年，亞歷山大又揮師南下，沿地中海東岸前進，攻佔敘利亞，未經一戰進入埃及，被埃及祭司宣布為「阿蒙神（埃及太陽神）之子」，他自封為法老。聯軍在尼羅河口興建亞歷山大城，該城由亞歷山大親自勘查設計，作為繼續東征的後方基地。
公元前331年春，亞歷山大回師西亞，假道腓尼基向波斯腹地推進，尋波斯軍主力決戰。10月初，在底格里斯河東岸的高加米拉以西與波斯軍主力對陣。亞歷山大以不足5萬騎兵，將號稱百萬、且配備戰車戰象的波斯大軍徹底擊潰，大流士三世狼狽逃竄，後被其部將謀殺，古波斯帝國及阿契美尼德王朝就此滅亡。隨後，馬其頓軍隊征服了波斯的全部領土，一個橫跨歐、亞、非三洲的亞歷山大帝國建立起來。
公元前327年，亞歷山大率軍由裏海以南地區繼續東進，進軍中亞，經安息（帕提亞）、阿里亞、德蘭古亞那，北上翻越興都庫什山脈，到達巴克特里亞（大夏）和粟特。大軍遇到了當地居民的激烈反抗，亞歷山大在作戰中也數度負傷。為了加強對廣大征服地區居民的統治，亞歷山大在多處興建城垣要塞，這些要塞也以亞歷山大的名字命名，並留駐守軍。公元前325年，亞歷山大率軍侵入印度，在印度河谷建立了兩座亞歷山大城，迅速佔領了西北印度的廣大地區。他還想進一步征服印度的心臟地帶，向恆河流域進發。但是由於印度人民的頑強抵抗，加之瘧疾的傳染，毒蛇的傷害，而且經過多年遠途苦戰，兵士疲憊不堪。兵士拒絕繼續前進，要求回家。亞歷山大不得不放棄東進計畫，於公元前325年7月將大部隊撤出印度。分兩路西返，一路在海軍將領涅阿霍斯的率領下取海道由伊朗海灣入波斯灣；一路由亞歷山大親自率領，從陸路經卡曼尼亞沙漠而歸。公元前324年初，兩路大軍會師在巴比倫境內的奧皮斯城。由於長途跋涉，亞歷山大的部隊損傷極大，將近10年的亞歷山大遠征，終於結束了。
亞歷山大在征服的土地上，建立了一個龐大的帝國，其版圖西起希臘，東到印度河流域，南臨埃及，北及伊朗高原至中亞，首都設在巴比倫。為了籠絡人心，亞歷山大推行了帶有東方特色的統治政策，不僅保留一部分波斯帝國的地方行政機構和官員，而且還吸收了許多亞洲人加入馬其頓軍隊。為了謀求與東方民族的和解，亞歷山大還推行所謂的「歐亞聯姻」政策，他親自帶頭同波斯國王大流士的女兒斯塔提拉結了婚，許多馬其頓的將領也都娶了波斯顯貴的女兒，同日參加婚禮的多達1萬對。
亞歷山大的征服野心並沒有因為帝國大業的成就而有所減退，他計畫侵入阿拉伯與波斯帝國北面的土地，還想再次入侵印度征服羅馬、迦太基和地中海西岸地區。但是公元前323年6月，亞歷山大死於惡性瘧疾，由於死亡的突然降臨，亞歷山大未明確他的接班人，導致爭奪王權的激烈鬥爭。將領們紛紛自立為王，橫跨歐亞非三洲的馬其頓王國從此分裂為若干個希臘化的國家。亞歷山大龐大的帝國只存在了短短的13年。