十五世紀九〇年代，小說家馬泰奧．班代洛還只是個孩子，那時他在米蘭的聖瑪利亞感恩教堂道明會修道院做見習修道士，他的叔叔維琴佐當時是那裡的院長。班代洛常會看著李奧納多．達文西在修道院的北牆上工作來打發時間，李奧納多當時正在繪製斯福爾扎時期一幅偉大的傑作——《最後的晚餐》。
「他一大早就到了，爬上鷹架馬不停蹄地就開始工作。有時他會在那裡從早幹到晚，手裡一直都拿著畫筆。他畫個不停，常會忘記吃飯或喝水。有時候，他會連續幾天不碰畫筆，一天中有好幾個小時佇立在他的作品面前，雙臂交叉放在胸前，獨自一人用挑剔的眼光審視著畫中的人物。我也看到過他在中午太陽最烈的時候，好像突然有急事要做一樣，放下手頭正在製作的黏土模具，離開韋奇奧宮直奔聖瑪利亞感恩教堂。他也不找個陰涼處休息片刻，就趕忙爬上鷹架，拿起畫筆在牆上塗上一兩筆，然後隨即轉身離開。」
班代洛是在幾十年之後寫下了這段文字。簡言之，李奧納多大概是從一四九五年開始繪製《最後的晚餐》，因此就不能同時忙著「製作」銅馬的黏土模型（該模型於一四九三年底向世人展示）。但這段文字仍能使我們窺探到這位大師工作時的情況。我們能從中感受到他的創作節奏、熱情的迸發，以及期間不時陷入沉思的狀態。這種沉思著實令人不解，尤其是讓付錢的顧主們備感迷惑，他們還誤以為他是在胡思亂想而耽誤了工作。這段文字向我們展示了一幅絕妙的圖景：李奧納多頂著正午的烈日，大步流星穿過街道，沒想過要找個地方歇一歇腳，躲一下日頭，腦子裡只有偶得的靈感，想到了解決構圖細節上一些小問題的方法。「一兩筆」這幾個字告訴人們他的藝術靠的是不斷地辛苦積累。人們在聖瑪利亞教堂修道院牆上看到的那一大幅畫面正是由上萬次畫筆的點觸和上萬次十分細緻的決定組成。想到世人皆知的著名畫作，人們不禁會問自己——為什麼這幅畫會是這樣而不是其他的樣子？事實上，畫面的方寸之間都經過畫家的不懈奮鬥，浸滿了他的心血。
聖瑪利亞感恩教堂坐落在古老的韋爾切利納門之外，西邊就是斯福爾扎城堡。在很長一段時間裡（你可能也聽說過），那裡幾乎就是塊建築工地。一四九二年，為了修建布拉曼特設計的新講壇和穹頂，唱詩區和教堂半圓形的後殿被拆毀，緊接著人們決定擴大與其毗鄰的修道院。到一四九五年底，修道院餐廳的翻新工作已經完成。就在那一年，多納托．迪．蒙特法諾在該修道院的南牆上繪製了壁畫《耶穌受難圖》，壁畫上標有這個日期。《最後的晚餐》就畫在《耶穌受難像》對面的牆上，大概也是在這一年開始繪製的。教堂的整個修繕工程是由盧多維科發起並出資進行的。他希望這座整修後的教堂未來能成為斯福爾扎的陵墓，一座符合公爵王朝地位的紀念碑。他的妻子比阿特麗斯的突然去世和他的女兒比安卡一四九七年的不幸去世令這件事顯得更加迫切。連續失去兩個親人對「摩爾人」來說是一個沉重的打擊，摩爾人也因此轉而篤信宗教，度過了一段陰沉低調的日子。盧多維科對感恩教堂除了金錢上的投入之外，還帶有感情上的寄託，他常會獨自一人去修道院的餐廳吃飯。李奧納多的這幅偉大壁畫（mural）——因為是用油畫顏料畫的，因此嚴格講還不能算作是一幅濕壁畫（fresco）——就這樣成為這個享有盛名的斯福爾扎工程的重頭戲。這幅不落俗套的作品成為這個優美的追新求異的修繕工程的完美收官之作。
要追溯「這幅永不安寧的傑作」（布克哈特語）的製作過程，我們首先要看一下溫莎皇家圖書館收藏的一頁筆記，筆記上有一幅早期用鋼筆作的構圖習作。這張習作仍然以傳統的「最後的晚餐」的構圖法為基礎——猶大沒有與眾人坐在一起，他坐在桌子的左側，頭扭向後面；而聖約翰則坐在耶穌旁邊，已經睡著了，旨在表示在耶穌宣布他被出賣的消息的時候，他「斜靠在耶穌的懷裡」。這兩種形象在最後的版本裡都被棄之不用。
這頁紙上還有兩幅相對獨立的素描。左邊那幅素描裡出現了十個人物，也許這頁紙已被人剪過，把三個人的形象剪掉了。這群人後面輕淡地畫了些拱形結構，這是關於圖畫背景的最早想法，即「最後的晚餐」發生的「頂樓」。右邊的素描中出現了四個人物，但畫面重心主要放在耶穌和猶大這兩個人物身上。李奧納多在這裡集中表現明確叛徒身分那戲劇性的一刻：「與我共用一個碟子的那個人將要背叛我。」（《馬太福音》二十六：二十三）畫中的猶大從他的凳子上起身，正把手向那個碟子伸去。李奧納多試著給耶穌的雙手畫出兩種姿勢——一種是手抬起來好像要伸向前方；另一種是手已經碰到了碟子，與叛徒的手發生短暫的接觸。這幅小一些的素描突出了故事的焦點，找到了戲劇性的支點——兩手相觸的動人心魄那一刻。為了突出表現這一瞬間，李奧納多把傳統的「最後的晚餐」的故事追溯到《聖經》之前的一個場景，即聖餐儀式。
較小的那幅素描中還描繪了正在熟睡的聖約翰，耶穌的手臂放在他的背上，這裡表現出耶穌的「仁愛」，正如《聖經》上所寫，約翰是「耶穌所愛的」門徒。而在那些漠視宗教的懷疑論者們看來，約翰「斜靠在耶穌的懷裡」是同性戀的表現。一百年以後，在歸為克里斯托夫．馬洛的諸多褻瀆行為中有一項便是：耶穌對約翰懷有「一種特別的愛」，並「把他當做所多瑪的罪人利用」。人們不禁想起那段薩爾塔雷洛插曲，其言外之意是官方不贊成用帶有女子氣的年輕男子作模特兒來描繪天使和年幼的耶穌。李奧納多在最後的作品中將人物全部分開，但約翰仍是所有門徒中最年輕俊美的一個。
不久之後，李奧納多又用紅粉筆畫了一幅草圖，後來這幅紅粉筆畫又被其他人用墨水描了一遍，該圖現存放在威尼斯學院美術館。該草圖顯得比較粗糙，很大程度上應歸咎於墨汁的影響，不過《最後的晚餐》的均勻的布局在這幅草圖上已初顯端倪。眾門徒被分成了幾組，畫面更注重人物的個性特徵。為了明確人物身分，人物形象下面出現了匆忙寫就的說明文字（其中菲利普被提到了兩次）。但猶大仍然在桌子的靠近觀者的一側，約翰依然睡得很沉。
這些素描讓我們看到了李奧納多關於此畫的早期想法。他迅速而聚精會神地做好微型藍圖，心中不停問自己——是這樣畫還是那樣畫？但正如李奧納多常會表現的那樣，他的繪畫基礎非常紮實，儘管這些素描是第一批真正為聖瑪利亞感恩教堂的《最後的晚餐》所作的習作，但我們在他的素描簿中找到了另一張年代更早的紙張，可以追溯到十五世紀八〇年代，上面畫著三幅互有關聯的素描：一群人坐在桌子旁邊，有一人單獨坐在桌前，雙手托著腦袋，還有一個人毫無疑問就是耶穌，他的手指指向那個命中註定的碟子。這三幅素描並不是為《最後的晚餐》所作的習作，因為畫中只有五個人坐在桌旁愉快地聊天以打發時間，他們並不是耶穌的門徒。畫中場景可能是發生在某次鄉村的歡宴中，人們圍坐在桌前。但不知是什麼激發了李奧納多的靈感，使他在同一頁紙上迅速畫下吃聖餐的基督這一令人心酸的場景，十五年之後這個想法終於在那幅偉大的米蘭壁畫中開花結果。
溫莎皇家圖書館和威尼斯藏有的素描的重心逐漸從整體布局轉移到單獨人物形象特徵上面。溫莎皇家圖書館藏有著名的系列頭像，大多數用紅粉筆畫成，有一些已經畫得比較完整。那些人物形象終於變得清晰起來：猶大、彼得、大雅各、聖菲利普（幾乎可以肯定，最後兩個形象用的是同一個模特，只不過在圖畫中被賦予了鮮明的個性特徵）。其中有一幅聖約翰雙手的習作，畫面非常精美；還有一幅習作上畫著聖彼得的衣袖。「福斯特筆記本」中還有一些簡短的評論，對這些習作進行了補充——某位來自帕爾馬的亞歷山大為耶穌的手提供原型；「住在比塔的克里斯托法諾．達．卡斯蒂廖內的頭部的形狀很美」。其中有一處筆記，標題非常簡單，就寫著「耶穌」兩字，李奧納多在下面寫著「摩塔洛紅衣主教手下的喬瓦尼．孔蒂」，這個人可能就是耶穌的模特。亞拉岡有位消息靈通人士名叫路易吉，他在一五一七年親眼見過《最後的晚餐》，據他記載，畫中的一些門徒是「米蘭朝臣和知名市民的真實肖像」。
在一個著名的片斷中，李奧納多列出了一些門徒聽到基督宣言後的各種反應：
一個正在喝酒的門徒把酒杯放回原位，把頭扭向說話人。
一個扭動手指的人，轉向他的同伴，表情十分嚴肅，展開雙臂，露出掌心，肩膀上聳，碰到了他的耳朵，驚訝地張大嘴巴……
一人轉過身，手裡拿了一把刀子，碰倒了桌上的玻璃杯……
一個人身體前傾望著說話者，雙手遮住了自己的眼睛。
其中一些人物描寫在最後完成的壁畫中得到了體現，比如白鬍子的聖安德魯（從左邊數第三個人）攤開他的掌心，聳起他的肩膀。而其他人的動作都發生了改變，轉過身、手中拿把刀子的那個人變成了聖彼得，而碰倒玻璃