最早可以確定李奧納多對解剖學產生興趣的素描和筆記作於十五世紀八〇年代末。這些素描和筆記只是他影響最為深遠的一大成就的開端。就他的實際貢獻或影響力來說，他在解剖學方面取得的成績要遠大於他在工程、發明和建築方面的成績。他繪製的人體圖和記錄的相關筆記要比前人在這方面的成就更為嚴格和準確。他的人體解剖素描為揭示人體器官提供了全新的視圖，就像他的機械素描與機器的關係一樣。進行這種探索需要頑強的意志和勇氣，會受到傳統禁忌的阻礙和教條主義者的質疑，而且還需要在屍體冷卻之前在緊張的時間內，進行令人厭惡的解剖。李奧納多的解剖活動體現了他「勇於實踐」的工作理念，這是對先哲——加倫、希波克拉底和亞里斯多德被普遍接受的智慧的剖析和再評價，這三人當時依然是醫學派別的主流。
傳統觀念認為解剖學太過古怪，因為人是按照上帝的樣子生出來的，因此不能像機器那樣被大卸八塊。早期的人文主義者科盧切．薩盧塔蒂就曾寫道，解剖學揭示了「自然所一直精心隱藏的東西」，「我不相信如果在看到人體深處的時候，有人能不潸然淚下。」李奧納多的解剖活動至少有一次使自己與教會發生過對立。那是一五一五年的羅馬，一個居心叵測之人「千方百計阻撓我進行解剖，不僅在教皇面前公開指責我，還在醫院裡喋喋不休」。
李奧納多的解剖活動屬於科學研究，同時也與藝術領域有著緊密聯繫，解剖學拉近了科學與藝術的距離，或者表明兩者之間根本就不存在什麼距離。解剖學同幾何學和數學一樣，都是繪畫的基礎。在一幅畫出頸部和肩膀神經的解剖圖的下面，李奧納多寫道：「這種表現形式對一名優秀的繪畫者十分重要，就好比優秀的語法家要知道單詞的拉丁文起源一樣。」你是否還記得，《最後的晚餐》中李奧納多用人物的緊繃而又扭曲的頸部肌肉來表現當時戲劇性的一刻。李奧納多對解剖學的興趣，就像稍晚一些對光學的興趣一樣，是他從事繪畫的必然結果，也許更準確地說是他在米蘭作坊向弟子和學徒傳授繪畫技藝的必然結果。「畫家哲學家」的理想觀念也隨之產生，李奧納多的藝術是建立在他對描繪之物的深厚的科學知識之上。他也是自此開始發奮撰寫小冊子和專題文章，這些文章在他死後被收錄進他偉大的《論繪畫》中。在早期的傳記作家看來，研究解剖不完全是件好事。焦維奧確信李奧納多藝術方面的低產是因為他將大把的時間用來研究「藝術之下的學科」，主要是研究解剖學和光學。瓦薩里也認為在這些領域探索並不重要，最終會削弱他的藝術創作。
李奧納多應該可能跟韋羅基奧學過解剖。佛羅倫斯十五世紀七〇年代的藝術表現風格，比如安東尼奧．德爾．波萊沃洛的繪畫和韋羅基奧的雕塑，都帶有強烈的人體解剖的細節和戲劇性。波萊沃洛對人體肌肉曾做過十分細緻的研究，這顯然是藉助解剖進行的，隨後他創作了著名的《裸體人大戰》。李奧納多應該知道佛羅倫斯的解剖專家安東尼奧．貝尼維尼，他倆可能還彼此相識，貝尼維尼還是羅倫佐．德．美第奇的朋友。貝尼維尼研究過心臟和其他內部器官的功能，但他主要的興趣在於在死刑之後解剖屍體，尋找犯罪行為的體內表徵。他的專著《隱藏的原因》講述了他在進行二十次這種解剖之後的調查結果。
也許佛羅倫斯還有其他人在解剖學上影響過他，但是李奧納多對解剖學的興趣表現得最為強烈的時候還是在米蘭。一四八九年，李奧納多曾打算出一本關於這方面的「書」，這實際是一本手抄本專著。有一些文字資料可以證明這一點：有一些殘留下來的草稿和目錄列表，其中一張草稿的寫作日期是一四八九年四月二日。李奧納多後來給這個計劃中的書起名為《論人體的形態》，再一次證明了解剖學與繪畫之間的關係。
一四八九年，三十六歲的李奧納多開始思考世界通用的死亡的象徵：人的頭骨。在藏於溫莎皇家圖書館的三頁紙張上，他描繪了八幅關於頭骨的習作，有側面圖，有截面圖，還有從上方斜看頭骨的圖。這些素描畫得巧妙精緻，陰影效果優美，神祕怪異。不同的習作選取不同的角度——有畫臉部的血管，有的表示眼眶和顎骨之間的關係，還有得是俯看顱骨的空腔，描繪了顱內的神經和血管。但他繪製這些習作的主要興趣出現在畫邊的註解上。他的興趣不在科學研究，而是形而上學方面。其中一幅頭骨習作被按比例畫成方形，李奧納多在畫邊上寫著，「a—m線與c—b線相交的地方，就是各種感覺的交匯之所。」
他這裡特意強調的「各種感覺交匯之所」就是亞里斯多德曾假設的「共通感」。各種感觀印象在大腦這個地方得到協調和解釋。「共通感」被稱為大腦三個「腦室」中最重要的一個，另兩個一個是「印象區」，用以收集原始的感觀數據，另一個是「記憶區」，用以存儲加工後的信息。「腦室」只是指一個地方或腔室，但「共通感」除此之外還有其他作用。打個比方，「共通感」就類似於電腦裡的CPU（即中央處理器），兩者既是物質實體，又都是抽象的系統。在一些與頭骨習作同一時期創作的筆記中，李奧納多是這樣給這一傳統理論下定義的：
「共通感」用來判斷其他意識所提供的信息。古代的心思家們總結說，人的解釋能力來自於一個器官，其他五個意識將所有信息都送到那裡……人們說「共通感」處在大腦的中央，位於印象區和記憶區之間。
「共通感」因此就成為理智、幻想、智力，甚至是靈魂的來源。李奧納多繼續說道：
似乎靈魂就寄居在這個器官之內……名叫「共通感」。「共通感」並不是像許多人想的那樣遍布身體各處，而是應該集中在一個地方，因為如果靈魂到處都是的話，感官器官就用不著匯聚到一起……因此「共通感」就是靈魂之所在。
如果按照字面意思理解，我們會冒出這樣一個不同尋常的念頭：如上圖所示，在溫莎這幅成比例的頭骨習作中，李奧納多用座標方格找出了人類靈魂的實際位置。得出這樣的結論似乎太過簡單了。李奧納多其實是在提出問題，而不是得到結論。他指出這個理論是「古代的心思家們」提出來的，主要是亞里斯多德，他還暗示其他一些古代心思家認為靈魂在身體裡無處不在，比如柏拉圖和赫耳墨斯。不管怎樣，這是典型的李奧納多式的飛躍，提出了一個令人激動的發現的可能性。通過這些素描所體現的這種清晰而客觀的研究，當然有可能找到人腦中內部的各種祕密。如果真有「共通感」存在的話，我們肯定能將它找到；如果真有靈魂存在的話，靈魂肯定就在那裡。讀過這些筆記我們似乎能感到他既像是個魔術師，又像是個懷疑主義者。他小心翼翼地向頭骨的各個腔室和隱蔽處窺探，心中充滿好奇心，卻又不敢確定，腦子裡交織著「恐懼和期望，既對森然可怖的黑洞感到恐懼，同時又渴望知道洞裡是否藏有奇妙之物」。
在一張頭骨習作的背面他留下了日期：一四八九年四月二日，並記著還要研究的項目的列表。列表先是有關人的頭部和臉部，然後轉到頭骨部分：
是哪一根肌腱導致眼睛的運動，以至於一個眼睛的運動又帶動另一個眼睛的運動？
又是那些肌腱導致
皺眉。
揚起和低垂眉毛。
眼睛的眨動。
鼻孔的外張。
開啟嘴唇，而牙齒閉緊。
噘起嘴唇。
大笑。
驚訝……
他的問題的範圍突然變得寬泛起來，從大笑和驚訝表情的肌肉運動，突然轉向：
描述人類的起源，人是怎麼會在子宮裡的，為什麼八個月大的嬰兒不能在體外存活。
人為什麼打噴嚏。
人為什麼打呵欠。
癲癇
痙攣
癱瘓
凍得發抖
流汗
飢餓
睡覺
口渴
性慾
他接著轉向人體的肌腱和肌肉體系——「使肩膀到肘部運動的肌腱」，「使大腿運動的肌腱」等等。這個主題可以與另一份早期的習作聯繫起來，那幅習作畫的是胳膊和腿的肌腱。該習作畫得不夠細緻，表明它是李奧納多在解剖時作的，因此才會較為粗糙和倉促。
從這些解剖習作，我們能感到李奧納多那種趨向「全能」的衝動，這也成為他科學研究一個拖累：他必須要對萬事萬物重新進行解釋，每一個研究主題都揭示了許多其他需要研究的主題。
伴隨《論人體的形態》的研究還出現了一系列素描，這些素描用平面展現了人體比例，展示了人體各器官之間的數學比率。李奧納多這裡又一次受到維特魯威的影響。維特魯威是羅馬公元一世紀偉大的建築家和軍事工程師，唯有他的著作提出了關於人體和諧比例的理論和實踐。溫莎皇家圖書館藏有一些李奧納多這方面的素描，它們大約作於一四九〇年，其他一些素描已經失傳，但《惠更斯抄本》裡收錄了一些摹本，這是一個十六世紀下半葉彙編的一個手抄本，大概是米蘭藝術家