是柏拉圖式的愛情遊戲，還是真心相愛？籠罩在吉內弗拉畫像上的疑問現在出現在李奧納多的生活中。
一四七六年四月初，有人將一封匿名舉報信投進專門用來檢舉壞人的容器中，這種容器被放置在城市的大街小巷，人稱「桶」，它還有另一個更為形象的名字——「真相之洞」。這封信的一份被公證過的副本保存了下來，人們是在「守夜官」和「僧侶道德守望者」的文件中發現的，這兩個機構是佛羅倫斯的守夜機構，我們也完全可以將它們稱為當時的「刑警隊」。信的全文如下：
「致執政團的領導：我特此作證有個叫雅科博．薩爾塔雷利的人與哥哥喬瓦尼．薩爾塔雷利一起住在瓦凱雷奇亞大街的金匠店，這家店正好對著這個「桶」。雅科博穿著一身黑衣，十七歲上下。就是這個雅科博參與了多起猥褻的勾當，只要有人要他進行這種邪惡的事情，他都答應滿足他們的需要。這件事他幹過多次，換句話說，他為很多人都提供過這種服務，那些人的底細我心裡很清楚，現在我列出部分人的名字。這些人雞姦過上述那個雅科博。我向天發誓句句屬實。」
告密者隨後列出了四位所謂的雅科博的同伴或客戶的名字。他們是：
——巴爾托洛梅奧．迪．帕斯奎諾，金匠，家住瓦凱雷奇亞大街。
——李奧納多．迪．塞爾．皮耶羅．達文西，與安德烈亞．德爾．韋羅基奧住在一起。
——巴奇諾，緊身上衣製造商，家住奧爾桑米開萊教堂附近，住的街上有兩家大型剪羊毛的店鋪，街的一頭是謝爾奇家的涼廊。巴奇諾新開了一家緊身上衣店。
——李奧納多．托納博尼，又名「特里」，一襲黑衣。
這四個名字下面寫著：「無條件等待傳喚」。此處表明這四個人還沒有被抓起來，正在等待進一步的調查，如果受到法庭傳喚，必須出庭。兩個月之後，也就是六月七日，四個人被傳喚出庭。最終法庭似乎是撤消了這起案子。
這份聳人聽聞的文件一八九六年第一次被公之於眾，但之前就已經為人所知。在加埃塔諾．米拉內西編輯的瓦薩里《著名畫家、雕塑家和建築家傳》（出版於一八七九年）的第四卷中，他提到李奧納多曾被人「控告過」，但沒有明說是因何罪名。讓—保羅．里克特和古斯特沃．烏茲利都提到李奧納多曾有過犯罪經歷，也都未指明是何罪行。烏茲利稱之為「惡意的謠言」。在尼諾．斯米拉利亞．斯科奈米利奧最終將那封舉報信公布於眾之後，他不遺餘力地為李奧納多辯護，說在這件案子裡他已「不受懷疑」，還說他「從未參與過違反自然法規的各種形式的戀愛」。
自弗洛伊德以來，很多隨後對李奧納多的研究，像朱塞皮納．福馬戈利的《李奧納多的性愛》，都矢口否認李奧納多是個同性戀者，這似乎有些奇怪。現在人們普遍接受的觀點是：李奧納多是同性戀者。至少還有一位早期的李奧納多的傳記作家對這個問題沒有含糊其辭，他就是喬瓦尼．保羅．洛馬佐，他在寫於一五六四年的《論夢》中想像出下面這段發生在李奧納多與古代偉大的雕塑家菲迪亞斯之間的對話。菲迪亞斯詢問李奧納多關於一個他「最鍾愛的弟子」的情況：
菲迪亞斯：你跟他玩過佛羅倫斯人瘋狂迷戀的「後背遊戲」？
李奧納多：太多次了！你應該知道他是一個非常漂亮的年輕人，而且也不過十五歲左右。
菲迪亞斯：你這樣說難道一點兒都不害臊嗎？
李奧納多：一點兒都不！我幹嘛要害臊？在品德高尚的人眼裡，沒有什麼能比得上這件事更為光榮的……
洛馬佐這裡指的是李奧納多跟他來自米蘭的學生賈科莫．卡普羅蒂（又稱「薩萊」）的親密關係。瓦薩里在描寫這兩人關係的時候則謹慎多了，但他對薩萊的描述可能表達了同樣的意思：「他面目俊美，清秀標緻，一頭小鬈髮，李奧納多看了極為喜歡。」瓦薩里文中用了一個形容詞「vago」，意為「清秀標緻」，暗示了薩萊身上帶有一種「女人氣」。李奧納多生活中出現的其他的同性戀者可能還有：一個名叫保羅的學徒和一個名叫菲奧拉萬蒂的青年，這兩個人我會在後文介紹。儘管李奧納多素描簿裡的很多畫像都是男子裸體，但坦白地說，其中也有一些關於同性戀愛的素描。最明顯的一個例子是所謂的《天使變身》，畫中人前面的陽具已經完全勃起。人們也因此將這幅畫與藏於羅浮宮的《聖約翰》連繫起來，《聖約翰》可能是李奧納多最後一幅畫，那是一幅用感傷的筆觸畫的雌雄同體的年輕男子，他一頭鬈髮，就像李奧納多「極為喜歡」的薩萊的鬈髮一樣，鬈髮成為他十五世紀七〇年代初第一幅畫之後每幅畫中必會出現的東西。
有人一直將李奧納多的性取向看作是微微發亮的小天使和兩性人那種浪漫的、佩特似的模式。但他們必須要辯駁下面這些史料文獻，例如《阿倫德爾抄本》的四十四頁，這頁上有一個詞彙表，上面列有cazzo（它是「陰莖」的粗俗叫法，譯為「雞巴」）的各種同義詞；一本福斯特筆記本中有一幅素描，卡洛．佩德雷蒂謔稱其為「奔跑的雞巴」；《大西洋抄本》的新近被發現的一張散頁中，其背面畫著兩根陰莖，下面還連著兩條腿，樣子如卡通動物一般，其中一根用「鼻子」輕觸一個環，或者是個洞，畫的上方草草地寫著「薩萊」這個名字。這張塗鴉式的素描並非李奧納多所畫，但李奧納多的學生們卻不無幽默地告訴我們他們眼中的老師是什麼樣子。
不管怎樣，李奧納多的性取向是個見仁見智的問題。同許多研究李奧納多的學者一樣，筆者認為他是個同性戀。但是還有一些驚人的事實證明他不完全是個同性戀，對此我後面會詳細介紹。一四七六年對他的指控並非空穴來風，但也不能說就一定確有此事。
在十五世紀的佛羅倫斯，同性戀到底意味著什麼？可以預見，答案肯定是複雜而又不確定的。一方面，正如洛馬佐那段對話所暗示的那樣，同性戀愛當時非常普遍，雞姦這種「後背遊戲」與佛羅倫斯密不可分。德國人甚至用「佛羅倫斯人」來指代「雞姦者」。在美第奇家族的社交圈裡，人們公開接受同性戀行為，雕塑家多那太羅、詩人波利齊亞諾、銀行家菲利波．斯特羅奇的同性戀身分已是眾所周知。波提切利也是個同性戀，他與李奧納多一樣曾成為一封匿名舉報信的攻擊目標。後來湧現的同性戀藝術家還有米開朗基羅和本韋努托．切利尼。切利尼既是同性戀也是異性戀，他在自傳中津津樂道於玩弄多名女性的經歷，但一五二三年他還曾因與一名叫喬瓦尼．里戈利的人發生「有傷風化的行為」而被佛羅倫斯地方法官罰款。雕塑家班迪內利斥責他是「骯髒的雞姦者」，切利尼不屑地反唇相譏道：「我倒是希望上帝告訴我如何進行這項崇高的藝術，朱庇特與蓋尼米德在天堂裡就做過此事，而塵世間最偉大的國王和皇帝也無不如此。」他這段帶有諷刺意味的話與洛馬佐的對話中李奧納多表達的意思有著異曲同工之妙，同性戀愛是「品德高尚的人」從事的「更為光榮的事業」。
同性戀愛能夠流行的另一個原因是佛羅倫斯人對柏拉圖主義的狂熱。柏拉圖關於成年男子與男孩之間的愛情理想當時已是婦孺皆知，費奇諾在《論愛情》中也多次提到這一點。儘管費奇諾強調稱這種愛情是純潔的、無性的，但「柏拉圖式的」或「蘇格拉底式的」愛情卻成為同性戀愛的時髦面具。我們知道李奧納多與費奇諾的圈子關係緊密，也許風雅之士之間的性愛也是吸引李奧納多的因素之一。
這些事實對十五世紀七〇年代的佛羅倫斯的同性戀愛賦予了新的註解，但這與懲惡揚善的「守夜官」機構對同性戀的理解卻截然相反。名義上，雞姦算是死罪，同性戀者是要綁在火刑柱上被活活燒死（理論上是這樣，但實際上幾乎從未這樣做過）。「守夜官」收集的訴訟數據顯示，在七十五年多的時間裡（一四三〇—一五〇五），超過一萬個男人曾被控雞姦罪，粗略算下來平均一年要有一百三十個人。大約五個被控此罪的人中就有一個被判有罪。有幾個人會被施以死刑，其他懲罰犯人的方式有：流放、打烙印、罰款，以及公開施以羞辱。因此，一四七六年李奧納多被人控告並無任何特殊之處，但也是件不大不小的事情。幾乎無疑的是，他被人逮捕，可能會遭受酷刑的懲罰。令人無力的柏拉圖式的愛與「守夜官」的監獄之間相差十萬八千里。
此外，起訴同性戀者是大多數篤信上帝的人作出的更為廣泛的譴責。神職人員對同性戀往往是大加撻伐。貝爾納迪諾．達．謝納傳教士是其中的一個極端分子。他煽動信徒們向聖十字教堂的地板上吐口水，齊聲高喊：「施以火刑！燒死所有雞姦者！」一四八四年，局勢進一步惡化，一份教皇下達的訓諭將同性戀定性為「惡魔」，聲稱同性戀者「異端的變態行徑」無異於「與魔鬼亂淫」，之前人們常說巫婆能與魔鬼亂淫。文學作品對同性戀的態度也發生了一百八十度的轉變，但丁的《地獄篇》就是明證，同性戀者在書中受到了永恆的懲罰。罰到地獄第七層的是一些「違抗上帝、自然和藝術的人」